在选择
色谱填料时,需要考虑多种因素,以下是一些主要因素:
一、纯化目标和样品特性
1.纯化目标:明确纯化的具体目标,如提高纯度、去除杂质、分离特定组分等。这将有助于选择合适的填料和分离条件。
2.样品性质:了解待纯化样品的性质,包括其极性、分子量、溶解性、稳定性等。这些性质将决定所需的填料类型和分离模式。
二、填料类型
色谱填料主要分为硅胶基质填料、聚合物填料和其他无机填料等几类。
1.硅胶基质填料:
特点:硅胶是HPLC填料普遍的基质,具有高强度和广泛的适用性。可以通过硅烷化技术键合各种配基,制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱。
适用范围:适用于广泛的溶剂,从极性到非极性。但需注意其在水溶性碱性流动相中的不稳定性,一般推荐在pH 2~8范围内使用。
2.聚合物填料:
特点:多为聚苯乙烯-二苯或聚丙烯酸脂等,具有宽pH使用范围(pH 1~14),且在恶劣pH条件下不会降解。相对于硅胶基质填料,聚合物填料具有较强的疏水性,对蛋白质等样品的分离非常有效。
适用范围:特别适用于需要高pH或温度条件的纯化过程。
3.其他无机填料:
如石墨化碳黑、氧化铝、氧化锆等,这些填料具有特殊的性质,一般仅限于特殊的用途。例如,石墨化碳黑可用于分离某些几何异构体,氧化铝可在高pH流动相中使用,但需注意其与碱性化合物的强相互作用。
三、填料特性
1.粒度:粒度越小,柱效越高,但背压也越大。因此,在选择粒度时需要在柱效和背压之间做出平衡。目前分析分离主要用3μm和5μm填料进行。柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱,从而缩短分析时间。
2.重现性:不同厂家或型号的填料可能表现出不同的选择性,即使是同一厂家、同一牌号的填料及柱子的重现性有时也难以保证。因此,在选择填料时需要考虑其重现性是否满足需求。
3.稳定性:填料的稳定性也是选择时需要考虑的重要因素之一。特别是在恶劣pH或温度条件下使用时,需要选择稳定性好的填料以确保分离效果的一致性。
四、色谱柱参数
色谱柱的参数如内径、柱长、孔径等也会对填料的选择产生影响。
1.内径:内径越小,溶液在柱内的流通路径越短,扩散速率越高,能有效抑制峰展宽。高效液相色谱仪通常使用4.6mm和2.1mm的内径。
2.柱长:色谱柱的长度与理论塔板数N成正比,更长的柱长意味着更高的分离度,但运行时间也会相应延长。常用的色谱柱长度为150mm和250mm。
3.孔径:孔径越小,含孔量越高,比表面积和载碳量也越大,确保分子能顺利进出填料孔并与孔内表面进行分离分配。大分子使用300A孔径,小分子则使用80~120A孔径。
在选择色谱填料时,需要综合考虑纯化目标、样品特性、填料类型及其特性以及色谱柱参数等多个因素。
