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液相色谱工作流程

发布时间:2022-07-11      点击次数:459

无论正在利用何种相互作用,液相柱色谱法都分六个步骤进行:

柱平衡

样品装载

洗涤

洗脱

清洗

色谱柱再生

         一、柱平衡:

        大多数液相色谱方案从树脂平衡步骤开始。与目标蛋白质和所选树脂相容的缓冲液通过柱子。一种常见的做法是用 5-10 柱体积 (CV) 的平衡缓冲液平衡柱。例如,蛋白质与疏水相互作用树脂的结合在高离子强度下有效

         在选择平衡缓冲液时也要考虑目标蛋白质的特性,因为离子强度等缓冲液因素会受到蛋白质稳定性的限制;通常,人们会避免使用会使感兴趣的蛋白质变性或阻止其与固定相相互作用的平衡缓冲条件。

 DSC_2933

        二、样品加载:

         平衡后,将样品加载到色谱柱上。样品通常加载在与平衡缓冲液组成相同的缓冲液中,以最大限度地提高蛋白质与固定相的相互作用。

         样品可以手动上样或使用样品泵。某些类型的色谱法会限制可加载到色谱柱上的样品体积。另一个重要的上样考虑因素是大多数树脂结合蛋白质的能力有限。上样过多导致色谱柱过载会对分离产生不利影响。

          样品过载会影响色谱柱柱效,色谱柱受到污染不仅影响柱效更会降低使用寿命。在柱前安装保护柱可以有效保护分析柱免受污染。恒谱生色谱保护柱能过滤所有颗粒,积累非特定吸附材料,还将延长在微碱性pH下使用的分析主柱的寿命。

 反相色谱保护柱-DSC_1674

        三、洗柱:

        一旦蛋白质被固定在固定相上,只与树脂微弱或非特异性相互作用的蛋白质通过用几柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱子来去除。这种洗涤缓冲液可以具有与平衡缓冲液相同的成分或包含破坏弱特异性相互作用的成分。

       例如,固定化金属亲和层析 (IMAC) 用高浓度的咪唑洗脱与树脂结合的蛋白质。一种常见的做法是使用包含中等浓度咪唑的洗涤缓冲液,以消除仅与树脂微弱结合的污染蛋白质。洗涤液相色谱柱子直到在洗脱液中检测不到蛋白质。当使用带有 UV 检测器的色谱系统时,洗涤色谱柱直到 280 nm 吸收读数回到基线。

          四、样品洗脱:

          在所有非特异性和弱相互作用的蛋白质都从树脂上洗掉后,通过改变通过树脂的缓冲液的组成,与树脂强烈相互作用的蛋白质会从柱子上洗脱下来。在离子交换色谱中,蛋白质用高离子强度的缓冲液或通过改变 pH 值来洗脱,以破坏固定目标蛋白质的静电相互作用。相反,与疏水相互作用树脂结合的蛋白质通过降低缓冲液的离子强度来洗脱。在亲和层析中,蛋白质通常通过引入竞争配体或通过切割亲和标签从柱中洗脱,也可以使用高盐缓冲液或改变 pH 值进行洗脱。其他洗脱方案可能涉及混合不同极性的溶剂以调整流动相中每种组分的溶解度。

 反相色谱空柱管-DSC_2884

          洗脱条件可以线性梯度方式或逐步方式改变。通常,选择梯度洗脱方案(其中流动相的组成随时间线性变化)来确定洗脱曲线和使感兴趣的蛋白质从树脂中释放出来的洗脱缓冲液浓度。一旦确定了该浓度,为了节省时间,可以设计一个逐步等度洗脱方案,其中流动相的组成在每一步都是恒定的,可以设计用于未来的纯化。

           注意:尺寸排阻色谱不需要更换缓冲液,因为它不依赖于流动相和固定相之间的特定相互作用。没有真正的洗涤和洗脱步骤,因为 SEC 仅依赖于大分子被多孔珠延迟的事实,而小分子以最小的树脂相互作用通过树脂。

           五、清洗:

            在目标蛋白质从树脂中洗脱后,任何与树脂结合的蛋白质都将通过增加洗脱缓冲液的强度进行洗脱。此步骤允许色谱柱重复用于将来的分离。

            六、色谱柱再生:

          在剥离与介质结合的剩余化合物后,柱子要么用平衡缓冲液饱和以供后续重复使用,要么用存储缓冲液填充。


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